01

OD600的應(yīng)用--幫助了解細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)

OD600是指在600nm波長(zhǎng)處的吸光值，常常被用于分析細(xì)菌生長(zhǎng)和進(jìn)行抗生素敏感性測(cè)試，在細(xì)菌檢測(cè)中，測(cè)量波長(zhǎng)需要選擇在生物材料吸光度最小的范圍內(nèi)。因此，這些細(xì)菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)量通常使用600-670nm左右的紅色波長(zhǎng)。在細(xì)菌連續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中，在不同的時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)菌液的OD600值，然后以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600為縱坐標(biāo)，描繪細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。結(jié)合生長(zhǎng)曲線(xiàn)，可以評(píng)估細(xì)菌所處的生長(zhǎng)階段，進(jìn)而可以確定合適的誘導(dǎo)表達(dá)或收獲的時(shí)間點(diǎn)。

02

OD600 測(cè)量菌液/細(xì)胞濃度的原理

細(xì)菌密度的測(cè)量方式是通過(guò)光的散射，也就是看渾濁程度而不是吸光度，光的散射程度反應(yīng)的是細(xì)胞的生物質(zhì)量而不是細(xì)胞個(gè)數(shù)，也稱(chēng)濁度測(cè)量。濁度法測(cè)量非均質(zhì)溶液中是否存在固體顆粒。固體顆?？梢允羌?xì)胞、沉淀、聚集體或溶液中存在的任何其他固體物質(zhì)。顆粒會(huì)散射光束中的光子，因此儀器檢測(cè)器會(huì)檢測(cè)到較低的光強(qiáng)度。這種現(xiàn)象與吸光度測(cè)量截然不同，吸光度測(cè)量是指光子被均勻溶液中的特定染料吸收，吸光度和濁度散射的基本區(qū)別如圖 1 所示。

圖1：吸光度和濁度散射的基本區(qū)別, 在吸光度測(cè)定中，由于光被樣品吸收，光電探測(cè)器中的光強(qiáng)會(huì)減弱（A）；在濁度測(cè)定中，入射光由樣本中的細(xì)胞/粒子隨機(jī)產(chǎn)生散射。這將導(dǎo)致方向的不確定性。繼續(xù)沿直線(xiàn)傳播的光會(huì)進(jìn)入檢測(cè)器，光強(qiáng)也會(huì)減弱（B）

03

使用不同的設(shè)備測(cè)量OD600細(xì)菌濃度可能得到不同的數(shù)值

對(duì)于具有濁度的樣品，如細(xì)菌溶液、細(xì)胞培養(yǎng)物，測(cè)量的“吸光值”是由于光散射，而不是溶質(zhì)分子光吸收的結(jié)果。由于光散射的程度受系統(tǒng)光學(xué)特性(比色池和儀器出口狹縫之間的距離、單色器光學(xué)特性、狹縫幾何特性等)的影響，使用不同類(lèi)型的分光光度計(jì)測(cè)量同一樣品時(shí)，可能會(huì)得到不同的OD600讀數(shù)。

那我們來(lái)看下主要有哪些原因影響濁度的測(cè)量呢？

一是濁度測(cè)量受樣品中顆粒濃度的影響

濁度測(cè)量總是在異質(zhì)樣品中進(jìn)行，一般需要測(cè)量96/ 384 孔板，現(xiàn)在多數(shù)酶標(biāo)儀通常使用相當(dāng)窄的測(cè)量光束。通常情況下，微孔板光度計(jì)的光束直徑不到一毫米，當(dāng)光束穿過(guò)96孔板的孔時(shí)，測(cè)量光束只能覆蓋樣品體積的很小一部分（圖2）。另外，現(xiàn)代微孔板光度計(jì)的采樣時(shí)間也很短，通常為毫秒級(jí)，這些對(duì)于濁度測(cè)量來(lái)說(shuō)并不是最佳選擇會(huì)增加變化。比如液體中的固體顆粒并非處于靜止?fàn)顟B(tài)，而是在整個(gè)液體中自由漂浮。因此，當(dāng)樣品中只有少量固體顆粒時(shí)，在重復(fù)測(cè)量中，相同數(shù)量的顆粒出現(xiàn)在光束內(nèi)的概率很低。如果樣品中有100 個(gè)顆粒，那么測(cè)量光束區(qū)域內(nèi)的顆粒數(shù)最有可能是1個(gè)，但隨機(jī)情況下可能是0個(gè)或2個(gè)，甚至3個(gè)。當(dāng)采樣時(shí)間也以毫秒為單位時(shí)，液體中顆粒的動(dòng)態(tài)流動(dòng)不會(huì)明顯改變單個(gè)測(cè)量中的這種情況。因此,當(dāng)OD值較低時(shí)，檢測(cè)精度可能會(huì)明顯降低，吸光度檢測(cè)的 CVs% 也會(huì)大于正常值。

同樣，當(dāng)樣品中的顆粒數(shù)量增加到非常多時(shí)，從顆粒上散射的光子會(huì)撞擊到另一個(gè)顆粒并重新散射。這將導(dǎo)致一些散射光子經(jīng)過(guò)多次散射后到達(dá)檢測(cè)器。因此，濁度測(cè)量的線(xiàn)性測(cè)量范圍總是低于吸光度測(cè)量。

二是不同儀器分光光度計(jì)的設(shè)計(jì)影響濁度測(cè)量

吸光度和濁度測(cè)量之間第二個(gè)非常重要的區(qū)別是，不同儀器的光學(xué)設(shè)計(jì)會(huì)影響所得到的OD值（圖 3）。因此，不同廠家生產(chǎn)的微孔板光度計(jì)沒(méi)法對(duì)同一樣品給出相同的OD值。這里有兩個(gè)影響因素：一是光電探測(cè)器收集窗口的大小，二是收集狹縫的大小。探測(cè)器窗口越大，收集到的輕微散射光子就越多，因此觀測(cè)到的OD 值就越低。還有一個(gè)主要問(wèn)題是樣品到檢測(cè)器的距離。如果檢測(cè)器距離樣品很遠(yuǎn)，即使是輕微散射光子也會(huì)到達(dá)檢測(cè)器；如果很近，即使是強(qiáng)烈散射光子也會(huì)被檢測(cè)器收集到。因此，這個(gè)距離對(duì)得出的OD 值影響也很大。由于每個(gè)制造商的光學(xué)設(shè)計(jì)不同，這兩個(gè)參數(shù)（距離和探測(cè)器的大?。┰趦膳_(tái)不同的儀器中永遠(yuǎn)不會(huì)相同。這些因素不會(huì)影響吸收測(cè)定，因?yàn)樵谖諟y(cè)定中光束形狀保持不變。檢測(cè)器的大小或距離不會(huì)改變到達(dá)檢測(cè)器的光量。

圖示3：檢測(cè)器收集窗口的大小和與樣品的距離都會(huì)改變所測(cè)得的OD值，因此不同的儀器會(huì)對(duì)相同的樣品給出不同的OD值。檢測(cè)到的OD值差異很容易達(dá)到20-40%。

比如下圖中，在濁度測(cè)定結(jié)果的偏差表明，Multiskan Sky 和 SkyHigh 采用了非常相似的光學(xué)設(shè)計(jì)，因此結(jié)果幾乎相同，但Varioskan LUX 和 Multiskan FC 采用了不同類(lèi)型的光學(xué)器件，因此與Sky和SkyHigh有很大不同，兩者之間也存在明顯差異。但在吸光度測(cè)量方面，所有四款酶標(biāo)儀的測(cè)量結(jié)果完全相同。

圖示4：不同型號(hào)酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度和濁度的比較

因此，對(duì)于OD600測(cè)量，不同酶標(biāo)儀的結(jié)果不能直接進(jìn)行比較。對(duì)于OD600測(cè)量，使用相同型號(hào)的分光光度計(jì)可以保障良好的重復(fù)結(jié)果。而對(duì)于不同酶標(biāo)儀的結(jié)果首先需要使用適當(dāng)?shù)男?zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

常規(guī)的酶標(biāo)儀檢測(cè)都具備了光吸收檢測(cè)功能，賽默飛多款酶標(biāo)儀具有單獨(dú)模塊用于濁度檢測(cè)，比如單功能酶標(biāo)儀FC，配有比色杯模塊的Multiskan SkyHigh 以及多功能酶標(biāo)儀Varioskan LUX等，都是核酸、蛋白質(zhì)、菌液濃度及其他物質(zhì)測(cè)量的多功能儀器，可為用戶(hù)提供完善的解決方案。